Research Journal of Recent Sciences _________________________________________________ ISSN 2277-2502 Vol. 3(IVC-2014), 34-41 (2014) Res. J. Recent. Sci. International Science Congress Association 34 Study of Clostridium difficile in South Gujarat region of India Patel P. V. and Desai P. B. Department of Microbiology, Shree Ramkrishna Institute of Computer Education and Applied Sciences, Behind P. T. Science College, Opposite Chowpati, Athawalines, Surat-395 001. Gujarat, INDIAAvailable online at: www.isca.in, www.isca.me Received 27th June 2014, revised 28th August 2014, accepted 14th September 2014 AbstractToxin-producing Clostridium difficile strains is a common cause of diarrhoea today. Clostridium difficile presently has been identified as a causative agent of a spectrum of diseases referred to as Clostridium difficile Infections (CDI). CDI can establish as self-limiting antibiotic-associated diarrhoea (AAD) and antibiotic-associated colitis (AAC) to severe and life threatening forms like; pseudomembranous colitis (PMC) and toxic megacolon. Indian studies have reported Clostridium difficile -associated Diarrhoea (CDAD) prevalence rates ranging from 7.1% to 26.6% and its incidence varies considerably from place to place. The present work was conducted with the objective to study Clostridium difficile and its prevalence in the South Gujarat Region of the Gujarat state of India. Alcohol Shock treatment was given to the stool sample, followed by enrichment of spores by inoculating an RCM broth (added with 0.1% sodium taurocholate). After 48 hr., subculture was made on CCFA medium. Plates were incubated anaerobically for 48hrs. The C. difficile isolates were identified by colonial characteristic, fluorescence under UV light and positive Latex Agglutination test. The isolates were further characterized by gram reaction for cellular morphology, spore staining and various biochemical tests as described in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Among 271 clinical stool investigated, 176 were of male and 95 were of female patients. In total 16 isolates have been obtained from total of 271 clinical samples i.e. the isolation rate is 5.9% during six month. Among this C. difficile has been isolated from 10 males (62.5%) and 6 females (37.5%). A case of PMC has also been reported in present study. Keywords: Clostridium difficile Infections (CDI), antibiotic-associated diarrhoea (AAD), antibiotic-associated colitis (AAC), Pseudomembranous colitis (PMC), toxic Megacolon, Clostridium difficile -associated Diarrhoea (CDAD). Introduction Clostridium difficile presently has been identified as a causative agent of a range of diseases referred to as Clostridium difficileInfections (CDI). CDI can manifest as self-limiting antibiotic-associated diarrhoea (AAD) and antibiotic-associated colitis (AAC) to severe and life threatening forms like; pseudomembranous colitis (PMC) and toxic megacolon. I n 1978, C. difficile was first identified as a cause of diarrhoea and in the last thirty years it has reached an epidemic state in both healthcare and community settings. There has been reports of increasing incidence and severity of CDI with severe outcomes in this years. The remarkable changes in the epidemiology of CDI during recent years have made CDI a global public health challenge. Emergence of a previously rare and more virulent strain, BI/NAP1/027 has been recognized as a main cause of increase in incidence of CDI. Increased toxin producing ability and high-level of resistance to third generation antibiotics have made this strain a very successful pathogen, particularly in healthcare settings. In addition to this observations says that the populations that were thought to be at low risk previously has now been identified to be acquiring and suffering from severe forms of CDI. Scientific knowledge and information about the epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and clinical management of C. difficileinfections (CDI) has developed immensely in the last decade or so. During the past several years, many newer methods for diagnostic testing of C. difficile infections have emerged4,5,6. Additionally, several other treatment modalities has also been worked out and available for CDI apart from traditional drugs viz., metronidazole and vancomycin; this include new drugs such as fidaxomicin and other options such as probiotic treatment and fecal microbiota transplantation. Microbiology of Clostridium difficile and brief about CDI: Clostridium difficile are anaerobic, gram-positive spore-forming bacilli. In 1935, it was initially detected in the fecal flora of healthy newborns by Hall and OToole. Clostridium difficile was considered to be nonpathogenic till 1978, when Bartlett and Chang et al identified it as the source of cytotoxin in the stools of patients suffering from pseudomembranous colitis (PMC). Clostridium difficile infection- a n intestinal disorder often associated with antimicrobial usage is now established as a leading cause of hospital-associated gastrointestinal infections. CDI is a tricky problem for the health-care system because the patients with CDI usually have longer stay in hospitals and at the same time it is also reported to be frequently associated with cause of large hospital outbreaks of diseases. Research Journal of Recent Sciences ______________________________________________________________ ISSN 2277-2502Vol. 3(IVC-2014), 34-41 (2014) Res. J. Recent. Sci. International Science Congress Association 35 Clostridium difficile is excreted in the faeces of patients as well as carriers. Also reported that 15% to 75% of healthy neonates acts as reservoirs for C. difficile. Additionally, the rate of asymptomatic carriage of C. difficile in healthy adults is 3% to 5% 10 and is prevalent in up to 30% of patients on antibiotics or those who are hospitalized11. The Clostridium difficile is transmitted via feco-oral route. It is mostly acquired from the hospital environment, by touching the inanimate objects or surfaces contaminated with faeces (spores of C. difficile). It can also be transmitted by health care workers through contact with contaminated patients or infected patients faeces. The incubation period of CDI is not precisely known. In most patients, infection is evident within 7 days after ingestion of spores, however the incubation period can extend up to 4 weeks12. Resistant C. difficile spores survive the stomach acidity and reach the small intestine where it germinates to give rise to the vegetative forms. In small intestine C. difficile proliferates in a situation of disturbed normal colonic flora, usually by exposure to antimicrobial agents. This leads to appearance of a broad spectrum of clinical conditions that ranges from 'asymptomatic carriage' to 'diarrhea of varying severity' to 'fulminant colitis' and even death13. Two large exotoxins, toxins A and B are released by proliferating C.difficile cells in the large intestine (C.difficile toxins i.e. toxin A and B are encoded by genes tcdA and tcdB respectively. These genes along with regulatory genes are located on a 21kb segment of chromosomal DNA referred to as the pathogenicity locus or shortly as paloc region). These toxins are responsible for the virulence and pathogenesis of C. difficile. Toxin-negative i.e. toxin non-producer C. difficile strains are considered nonpathogenic. In addition to toxins A and B, some C. difficilestrains also produce a third toxin called binary toxin (encoded by genes ctdA and ctdB, located outside the paloc region). The role of binary toxin in the pathogenesis of C. difficile has remained unclear; however, it has been detected in epidemic strains (e.g. BI/NAP1/027) and thus suggests its probable synergistic role in causing severe colitis along with two exotoxins14. Prevalence of CDI: Over recent decades, several epidemics of CDI have been reported in North America and Europe and it has demanded the need for surveillance of C. difficile strains all over the world and efforts should be put in force by the international associations working for the CDI15. Since 2005 outbreaks by C. difficile ribotype 027 has occurred in England and Wales, Ireland, Netherland, Belgium, Luxemburg and France and the same strain has also been detected in several countries like Austria, Scotland, Switzerland, Poland and Denmark16. As reported by Scroeder M.S.17, Clostridium difficile infections results in approximately 3 million cases of diarrhoea and colitis each year in United States alone and the case mortality rate is about 1 to 2.5%. In Asia, the consciousness and surveillance of CDI have remained poor. However, available reports from the limited studies executed throughout Asia indicate that CDI is also a significant nosocomial pathogen in this region, however, the true prevalence of CDI has remained unrevealed. In the situation of unregulated use of antibiotics in many Asian countries, the prevalence of CDI may be relatively high. In addition to this, molecular studies have showed that ribotypes 027 and 078, which have caused significant outbreaks in other region of the world, are rare in Asia. However, variant strains of ribotype 017 (toxin A-negative/toxin B-positive) have caused epidemics across a number of Asian countries18. Indian Scenario: Repeated occurrence of Clostridium difficileAssociated Diseases in an infected patient, as evident by the sudden recurrence of diarrhoea and other symptoms frequently within a week of discontinuation of treatment has made it a difficult clinical problem to manage12. There has been limited documentation on incidence of culture or toxin proven CDAD in India , probably due to the lack of technology and facilities for culturing anaerobic pathogens19, 20. Prevalence of CDAD in India as mentioned in available reports estimates to 15-30% of paediatric and adult patients taking antibiotics21-27. C. difficile was isolated from 25.3% patients (of all age groups) with diarrhoea in a study by Gupta and Yadhav. Niyogi and Dutta et al.28 reported C. difficile in 8.4% and cytotoxin in 7% fecal samples from children between 0-14 year of age group. In 7.3% of acute diarrhea patients C. difficile was identified as the sole pathogen in a study by Dutta et al., of which 82.4% were cytotoxin producers. In one study, Niyogi and Bhattacharya et al. isolated C. difficile from fecal samples from 11% hospitalized patients with diarrhoea and 2.9% from non-diarrheic controls. 87% of these isolates reported to produce cytotoxin; however the patients with diarrhoea had no history of antibiotic usage. Kochhar et al.29 verified that C. difficile was responsible for some of the exacerbations in ulcerative colitis patients even though there was no history of recent antimicrobial exposure or hospitalization. Vaishnavi et al. in 2011 reported that C. difficile toxin test was positive for 30% of hospitalized patients receiving single to multiple antibiotics for different diseases (of all age group), but only for 7% patients not receiving antibiotics. Chaudhry et al. reported that number of C. difficile positive cases have decreased during a 5 year study period and have ascribed this reduction in CDI cases to rigorous surveillance and an better antibiotic policy implemented in the hospital. Diagnosis of CDI: The clinical diagnosis of CDI is based on presence of appropriate clinical symptoms which includes watery diarrhea (defined as 3 loose stools in 24 hours) with or without abdominal pain, fever or ileus30,9. This clinical picture should be supplemented by a positive laboratory test for C. difficile or the presence of pseudomembranes in endoscopy both of which are highly suggestive of CDI. Among laboratory tests, Fecal leucocyte testing is not sensitive for CDI diagnosis as the test is positive in less than 30% of patients with CDI31. Stool culture is the most sensitive test and hence considered the "gold standard" for detecting C. difficile, but its acceptance in clinical laboratories is limited due to its slow Research Journal of Recent Sciences ______________________________________________________________ ISSN 2277-2502Vol. 3(IVC-2014), 34-41 (2014) Res. J. Recent. Sci. International Science Congress Association 36 turnaround time. Enzyme immunoassay (EIA) to detect toxins A and B produced by C. difficile is a rapid test but it lacks sensitivity. EIA for glutamate dehydrogenase enzyme is very sensitive but not very specific and so it is adopted by some laboratories as a screening test in combination with another more specific confirmatory test32. Another advanced test is Polymerase chain reaction (PCR), used to detect genes tcdB, which encodes the toxin and/or tcdC (which negatively regulates the toxin produced by C. difficileis considered an alternative gold standard based on studies reporting its excellent sensitivity, specificity and test-retest reliability33. Due to its fast turnaround time the PCR test is more widely accepted by different laboratories in place of toxin EIA32. The purpose of the present study is to have an overview of the prevalence of Clostridium difficile in South Gujarat region of Gujarat state of India. The work has been undertaken with our best knowledge that none of such work has yet been done in the South Gujarat region of India. Material and Methods Sample Collection: Diarrhoeal stool samples were collected from two civil hospitals and four private hospitals and laboratories receiving clinical samples for analysis from these hospitals of South Gujarat Region of the state Gujarat. The hospitals are located in Surat, Navsari and Valsad districts of Gujarat. Samples received for analysis were left-over samples. Ethical clearance was taken from respective hospital committee for the processing of Clinical samples collected. 271 samples were collected and processed during the period of July-2013 and December-2013. Month-wise distribution of sample collected is; 1 in July, 4 in August, 25 in September, 162 in October, 69 in November and 10 samples in December. Alcohol Shock Treatment: Spore selection technique i.e. Alcohol shock treatment was applied to the fecal samples before culturing it. For this, 1ml of sample in sterile micro-centrifuge tube was mixed with 1ml of absolute alcohol, vortexed to mix content well and then allowed to stand for 1hr. Culturing and Isolation of Clostridium difficile: 100l of the alcohol shock treated sample is inoculate in Reinforced Cooked Meat Medium (RCM broth) (Hi Media), added with 0.01% Sodium Taurocholate in a screw capped tube and incubated at 37C for 48hr. with the aim of enriching the growth Clostridium difficile and its sporulation. After 48hr. of incubation the RCM broth culture was inoculated on C. difficile selective agar medium- Cefoxitin Cycloserine Fructose Agar (CCFA) (Hi Media) containing 0.1% sodium taurocholate . Then the culture plates were incubated anaerobically, in an Anaerobic jar for 48hr. Isolates were identified based on colonial characteristic, fluorescence under UV light and positive Latex Agglutination test [HiC.difficileTM Latex Test, Hi Media]. Each isolate was described in terms of gram reaction, cellular morphology, spore staining, colonial characteristics and various biochemical tests as described in Bergey's Manual of Systemetic Bacteriology , 2nd Edition (2001)34. Latex Agglutination Test: Test was performed using HiC.difficileTM Latex agglutination Test (HiMedia). Latex particles coated with rabbit IgG antibodies specific for C. difficilecell wall antigens (20l) when mixed with a suspension of C. difficile colonies (20l prepared in isotonic saline) from selective CCFA agar medium, the finely dispersed latex particles agglutinated rapidly into aggregates that are visible to the unaided eye. Biochemical Characterization: The identified colonies were phenotypically further characterised by several biochemical tests viz. Lecithinase production, Lipase production, Aesculin Hydrolysis, Gelatine (2%) Liquefaction Test, Nitrate Reduction Test, Meat Digestion test, Indole test, Urease Test, Milk Reaction (for Lac Fermentation and Casein Coagulation), Starch Hydrolysis, Sugar Fermentation test for- Fructose, Mannose and Mannitol and Motility Test by Tetrazolium Reduction Method. Sequencing: One of the isolate was sent for partial sequencing to Yaazh Xenomics, Mumbai, India. Results and Discussion Total 271 diarrhoeal stool samples were analysed for C. difficile, collected from six big hospitals and associated laboratories of South Gujarat Region of India during the period of July-2013 and December-2013. A total 16 number of C. difficile isolates were identified by the growth characteristic on CCFA agar medium viz. large, creamy-yellow to gray, flat to slightly raised colony with irregular edge, showing yellowish green fluorescence under UV light. And 255 cases of diarrhoea were reported due to other organisms; may be other gram negative or gram positive bacteria as observed by gram reaction of RCM broth culture inoculated with alcohol shock treated fecal samples. Figure-1 Growth of C.difficile isolate on CCFA medium (Exposure under UV light) Research Journal of Recent Sciences ______________________________________________________________ ISSN 2277-2502Vol. 3(IVC-2014), 34-41 (2014) Res. J. Recent. Sci. International Science Congress Association 37 Only 16 isolates showed gram positive rods with terminal or subterminal spores in their RCM broth culture. All of them showed positive latex agglutination reaction when tested from growth on CCFA medium using HiC.difficileTM Latex agglutination Test kit (HiMedia). Figure-2 Latex Agglutination test result of C.difficile isolate grown on CCFA medium �&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;JJb_A#屡U'c A;xōtՌR&#xOv;&#x;&#xQ;&#xL&;&#xpNB;&#xj%;&#xu;GG;&#x`;&#x;&#x&;&#x$;&#xL*;&#x; U;&#x j;&#xgi ;&#x&;�n;%;&#xW;&#xIy;u;&#xGIb;&#xv;&#xjj;�;&#xI;&#x;&#xmEq;&#x;&#x ;&#xW;&#x q;�; &#x|5;&#x;&#x;&#xZ;&#xT;&#x;;&#xQ"; n;&#x믩;&#x.L;&#xՁe;&#x"7;&#xT;&#xpĬ;&#xΑX;&#xZ*;&#x.;Wd;&#x ޲;&#xH;&#x;&#x'g;&#x^.;&#x;&#xqJ;&#x;&#xg;&#x:;&#x ;&#x-~x;&#xvu;&#x;&#xn;&#xn;&#x~[:;&#x;@&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#xMC=;&;&#x@;&#xx p;&#x*Rw;00;JJb_A#屡U'c A;xōtՌR&#xMC=;&;&#x@;&#xx p;&#x*Rw;00;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x׀;&#x D;&#xyT;&#x;&#xٱ;&#x⓿;&#x/w;&#x;3;&#x}x6;&#x`;&#x}z}; ;&#x;&#x;&#x;&#xj;&#x|;&#x;&#xղ;&#x}%;&#xX;&#xN2;&#x;&#xm$; ~;&#xQ;>&#xyM@F;܉}fjzXۃuUt-sɍƘ_g5ݘI znjfdSc6⏝p7F rm+aTjP&8'Bњ[ߢV8rѡ*$x.h.6NM-/BR kL^DdsIgߕ$#& MdzaYTJڀT?,!ZW`!SCHFd%;]ٗ2&#x׀;&#x D;&#xyT;&#x;&#xٱ;&#x⓿;&#x/w;&#x;3;&#x}x6;&#x`;&#x}z}; ;&#x;&#x;&#x;&#xj;&#x|;&#x;&#xղ;&#x}%;&#xX;&#xN2;&#x;&#xm$; ~;&#xQ;>&#xyM@F;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;�&#xi; M; &#x"c;&#xV,;&#x*;&#xO{;&#xY;&#xGڤ;&#xJ;&#xN";&#xX;&#x^;&#xs@; X;&#x;&#xX;&#x_Z;&#xx;�&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;�&#xi; M; &#x"c;&#xV,;&#x*;&#xO{;&#xY;&#xGڤ;&#xJ;&#xN";&#xX;&#x^;&#xs@; X;&#x;&#xX;&#x_Z;&#xx;�&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;3TUgFFFd={h{@&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;Ǝ=3od;xu~=b0?X^'[%Jʥ K!f0GrX|Ժ9.WlaGS!Y2'ܰY/ID�&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;ID&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;�&#x;&#xs63;&#xڭ;W;&#x_;&#xO;&#x^y00;�&#x;&#xs63;&#xڭ;W;&#x_;&#xO;&#x^y00;�&#x;&#xs63;&#xڭ;W;&#x_;&#xO;&#x^y00;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;L Nrr:JVIҔajh6 ncaԎLNf=1GMA?2DQ6B,MnF SdF% ;bu`iuL Nrr:JVIҔajh6 ncaԎLNf=1GMA?2DQ6B,MnF SdF% ;bu`iu&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;L Nrr:JVIҔajh6 ncaԎLNf=1GMA?2DQ6B,MnF SdF% ;bu`iuL Nrr:JVIҔajh6 ncaԎLNf=1GMA?2DQ6B,MnF SdF% ;bu`iu&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;Uh %KGɜlUyM!mdkZWgmOCt yL4- j0O}aUh %KGɜlUyM!mdkZWgmOCt yL4- j0O}a&#x`T;&#x;-p;L`;&#x!;&#xQ/;&#x:Yq;&#xg;&#xQ; L;[I;&#xJG;&#x&~;&#xgL;&#xh; &#x$K;&#xr00;&#x`T;&#x;-p;L`;&#x!;&#xQ/;&#x:Yq;&#xg;&#xQ; L;[I;&#xJG;&#x&~;&#xgL;&#xh; &#x$K;&#xr00;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /; olo;&#xrs 3;u&#xiY;&#x;&#xw;&#x};&#xׄ;&#x;&#xO޼};&#x;&#x;l;&#xMFN6;&#x l;&#xҀd;&#xN;&#x+;&#xlݴ;&#xa ;&#x =;&#x;&#xrz;&#xO3;&#xVVP;&#x֡U;&#x{M;&#x’;&#xz;&#xG,;&#xz#,;&#xJxq;&#x{;&#xze.;J;&#x;&#xh;&#x; N ;
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ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 2; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 2; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 2; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;˜ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;˜ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;” /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;” /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;” /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;” /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‘ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‘ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‘ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;ˆ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;ˆ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‚ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‚ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‚ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;‚ /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;x /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;x /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;x /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;x /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;s /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;s /; olo;&#xrs 3; EI Q q 519 0 0 2 3837 3314 cm BI /CS/RGB /W 173 /H 1 /BPC 8 /F/Fl /DP&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;h /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;h /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;h /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;c /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;c /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;c /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;X /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;X /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;T /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;T /; olo;&#xrs 3; EI Q q 474 0 0 2 3861 3308 cm BI /CS/RGB /W 158 /H 1 /BPC 8 /F/Fl /DP&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;T /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;T /; olo;&#xrs 3; EI Q q 474 0 0 2 3861 3308 cm BI /CS/RGB /W 158 /H 1 /BPC 8 /F/Fl /DP\n&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;I /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;I /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;C /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;C /; olo;&#xrs 3; EI Q q 474 0 0 2 3861 3308 cm BI /CS/RGB /W 158 /H 1 /BPC 8 /F/Fl /DP\n\n&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;6 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;6 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;0 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;0 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;0 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;0 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;0 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;0 /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;# /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1;# /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x%;&#xQ_; ݵ;&#x!d; g;&#xnP;�-WԏMM{!D1JϘέiz;KwJAr~?&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 1; /; olo;&#xrs 3;&#x%;&#xQ_; ݵ;&#x!d; g;&#xnP;�-WԏMM{!D1JϘέiz;KwJAr~?&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 9; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 9; /C;&#xolor;&#xs 30;-WԏMM{!D1JϘέiz;KwJAr~?&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 8; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 8; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 7; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 7; /C;&#xolor;&#xs 30;-WԏMM{!D1JϘέiz;KwJAr~?&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 5; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /C;&#xolor;&#xs 30;&#x/Pre; ict;&#xor 1; /C;&#xolum;&#xns 4; /C;&#xolor;&#xs 30; Figure-3 Gram stain of RCM broth culture of C. difficile Isolates Table: Biochemical Tests of C. difficile isolates S. No. Isolate No.Biochemical Test 2 8 14 34 37 51 55 56 96 122 137 153 157 158 222 261 1 Motility Test + + + + + + + + + + + + + + + + 2 Aesculin Hydrolysis + d d + + + + + + + d + + + 3 Indole test 4 Urease Test 5 Nitrate Reduction Test w + + + w + + + + 6 Gelatine Liquefaction Test (2%) + + + + + + + + + + + + + + + + 7 Meat Digestion Test + + + + + + + + + + + + + w w 8 Milk Reaction; Lac Fermentation + w + + w w + w + w + Casein Coagulation + + + + + + + + + + + + + 9 Lecithinase Production + + + + + w + + + + 10 Lipase Production + + + + + 11 Starch Hydrolysis 12 Sugar Fermentation; Fructose G G G G G G G G G G G G G G G G Mannitol G G G G G G G G G G G G G G G G Mannose G G G G G G G G G G G G G G G G A- Acid detected, G- Gas detected